重組?口蹄疫病毒鑒定、生長特性測定及滅活疫苗制備（一）
口蹄疫(foot-and-mouth disease,FMD)是侵害豬、牛和羊等重大動物的烈性傳染病。該病傳播迅速、傳染性極強、發病率極高，世界動物衛生組織(World Organization for Animal Health,WOAH)將其列為必報動物疫病，我國將其列為一類動物傳染病之首。FMD的暴發和流行嚴重影響發病地區的畜牧業生產，阻礙社會經濟發展，制約健康養殖，是全球畜牧業生產急需解決的重大動物疫病之一。
口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus,FMDV)屬小RNA病毒科(Picornaviridae)、口蹄疫病毒屬(Aphthovirus)成員。FMDV粒子由結構蛋白VP4、VP2、VP3和VP1各60分子組成的二十面體衣殼與單股正鏈RNA組成，其中結構蛋白VP4位于衣殼的內部，VP2、VP3和VP1位于衣殼的外部。O型FMDV粒子表面至少含有5個抗原位點：VP2和VP3各有1個抗原位點(位點2和4)，VP1含有3個抗原位點(位點1、3和5)，這些抗原位點是誘導保護性抗體產生的主要免疫原。其中位于VP1蛋白130?160位氨基酸的G-H環是誘導動物產生中和抗體最主要的抗原表位，在疫苗免疫保護應答中發揮著關鍵性作用。因此，FMDV G-H環一直是表位疫苗、合成肽疫苗等新型疫苗研究的熱門靶點。
我國是FMD流行的國家，其中O型FMD流行最廣，也最難防控。目前我國流行的O型FMDV主要分為3個拓撲型：古典中國型(Cathay)、中東-南亞型(Middle East-South Asia,ME-SA)和東南亞型(South-East Asia,SEA)。O型多拓撲型病毒株共同流行加劇了FMDV的變異，導致新變異毒株不斷出現，使現用疫苗與流行毒株的抗原匹配性下降或抗原不匹配，容易導致免疫失敗而引發新疫情的流行，給我國FMD防控提出了前所未有的挑戰。因此，迫切需要篩選高效、廣譜的FMD疫苗候選毒株。
為了發展能更好地防控當前流行的O型3個拓撲型FMD流行株，本研究借助FMDV的反向遺傳操作技術，在已建立含2個拓撲型(Cathay+SEA)FMDV結構蛋白基因全長克隆基礎上，將ME-SA拓撲型疫苗株G-H抗原表位基因替換其對等基因，構建含3個拓撲型FMDV結構蛋白基因的重組全長克隆，拯救重組FMDV，研究其作為豬疫苗候選株的潛力。
1材料與方法
1.1質粒、細胞和病毒
FMDV疫苗株O/HN/CHA/93(Cathay拓撲型)全長感染性克隆嵌合當前流行毒株O/NXYCh/CHA/2018(SEA拓撲型)VP1基因的全長質粒pOFS/NXVP1和半長質粒pSK-Z123/NXVP1均為中國農業科學院蘭州獸醫研究所構建保存。表達T7 RNA聚合酶的BSR/T7細胞和BHK-21細胞均為本實驗室保存。FMDV O/GXCX/CHA/2018(MH791316.1)、O/HB/HK/99、O/XJ/CHA/2017(MF461724.1)、O/NXYCh/CHA/2018(MH791315.1)均由國家口蹄疫參考實驗室分離保存。
1.2主要試劑
瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、DNA片段回收試劑盒、質粒抽提試劑盒、大腸桿菌(Escherichia coli)JM109感受態細胞、高保真DNA聚合酶、限制性核酸內切酶(BglⅡ、SpeⅠ、NotⅠ、PstⅠ)，寶生物工程(大連)有限公司；轉染試劑LipofectamineTM 2000、MEM培養基、2×MEM培養基，Invitrogen公司；RNA提取試劑盒，QIAGEN公司；滅活劑二乙烯亞胺(2-bromoethylamine hydrobromide,BEI)，Sigma-Aldrich公司。
1.3 G-H基因替換重組FMDV全長質粒的構建
以pSK-Z123/NXVP1為骨架，替換FMDV疫苗株O/TUR/5/2009(KP202878.1，ME-SA拓撲型)長約30個氨基酸G-H環基因的半長質粒pSK-Z123/NXVP1/TURG-H，由蘇州金唯智生物科技有限公司合成。pSK-Z123/NXVP1/TURG-H和嵌合全長質粒pOFS/NXVP1經SpeⅠ和BglⅡ雙酶切后分別回收約5 400 bp(pSK-Z123/NXVP1/TURG-H)和2個大小均接近3 000 bp(pOFS/NXVP1)的DNA片段，然后用T4 DNA連接酶連接、轉化，構建重組全長質粒pOFS/NXVP1/TURG-H。全長質粒用PstⅠ進行酶切鑒定，將符合預期的質粒送蘇州金唯智生物科技有限公司進行測序驗證。重組質粒含FMDV的基因組示意見圖1A，G-H環氨基酸差異見圖1B。
圖1重組FMDV構建方案示意圖
A：重組FMDV基因組質粒全長示意圖.B：重組VP1結構蛋白G-H環氨基酸的比對
1.4重組FMDV的拯救
重組質粒pOFS/NXVP1/TURG-H經NotⅠ內切酶37℃消化3 h后，用DNA片段回收試劑盒回收，具體步驟參照試劑盒說明書。取2μg回收的pOFS/NXVP1/TURG-H線性化DNA片段用LipofectamineTM 2000介導轉染至80%?90%BSR/T7細胞，并置于37℃、5%CO2培養。轉染4?5 h后，每孔加1 mL的MEM培養基。每隔12 h觀察細胞狀態，當轉染細胞出現明顯的致細胞病變效應(cytopathogenic effect,CPE)后，將其反復凍融后的上清液接種BHK-21細胞進行傳代，子代病毒用于后續試驗。
1.5重組FMDV的鑒定
1.5.1 RT-PCR和序列測定
取轉染細胞上清液，用RNA提取試劑盒提取總RNA，通過一步法RT-PCR試劑盒擴增病毒VP1蛋白基因。回收、純化目標PCR產物后送蘇州金唯智生物科技有限公司進行序列測定。PCR擴增和測序引物為VP1-F(5′-AGATAACA CAGGGAAAGCC-3′)和VP1-R(5′-CTGATGGC CTTCACTCCAGT-3′)。
1.5.2間接免疫熒光試驗(immunofluorescence assay,IFA)
將轉染細胞培養上清和親本病毒分別接種70%?80%滿單層BHK-21細胞。37℃孵育6 h后細胞用4%多聚甲醛4℃固定20 min，PBS漂洗3次；用Triton X-100室溫通透10 min，PBS洗滌3次；加入小鼠抗FMDV 3A單抗(1:200倍稀釋)，37℃孵育1 h，PBS洗3次；加入二抗(山羊抗小鼠IgG-FITC稀釋比例為1:400)，37℃作用1 h，洗去游離二抗后用熒光顯微鏡觀察結果并保存圖片。
1.6重組FMDV噬斑表型鑒定和生長特性測定
將10倍比系列稀釋的第6代重組FMDV和親本病毒各200μL/孔，分別接種培養于6孔板的BHK-21細胞，放在37℃條件下孵育，每10 min輕輕搖動1次，1 h后加入2 mL黃芪膠混合液(1份2×MEM，1份1.2%黃芪膠)。細胞靜置培養48 h后，加入固定液(甲醇:丙酮=1:1，體積比)固定30 min，經0.1%結晶紫37℃染色2 h后進行噬斑計數和噬斑直徑測量，并計算病毒噬斑形成單位(PFU/mL)。
將第6代重組FMDV和親本病毒的病毒滴度稀釋至5×106 PFU/mL，分別接種BHK-21細胞置于37℃孵育1 h。棄去未結合病毒液，補加5 mL MEM培養液繼續培養。每隔4 h收取樣品至16 h，凍融樣品后通過噬斑形成單位測定不同時間點的病毒滴度(PFU/mL)并評價其一步生長特性。
1.7滅活疫苗的制備
取第6代親本病毒和重組病毒各100 mL，反復凍融2?3次，4℃、6 000 r/min離心30 min，去除細胞碎片。收集的病毒液分別加入5 mmol BEI于28℃滅活30 h。滅活后的病毒接種BHK-21細胞進行安全性檢驗，檢驗合格的病毒抗原按照常規方法純化、濃縮后，按抗原:佐劑等體積比配制疫苗(146S抗原終濃度為6μg/mL)，疫苗制品置于4?8℃保存備用。
1.8豬的免疫
篩選FMDV結構蛋白/非結構蛋白抗體陰性的3月齡健康仔豬共計12頭，隨機分為2組，每組6頭，分別接種親本病毒疫苗和重組病毒疫苗，接種劑量為2 mL/頭份。免疫28 d后采血，分離血清，?20℃保存備用。
1.9病毒中和試驗
取免疫后28 d的免疫血清進行微量病毒中和試驗檢測針對3個拓撲型的4個譜系FMDV株(O/GXCX/CHA/2018、O/HB/HK/99、O/XJ/CHA/2017和O/NXYCh/CHA/2018)的交叉中和抗體水平。微量病毒中和試驗操作如下：免疫血清在96孔板中進行2倍比連續梯度稀釋；加入50μL病毒稀釋液[滴度為200半數組織培養感染劑量(tissue culture infective dose,TCID50)/0.1 mL]，同時設置病毒回歸對照(100 TCID50、10 TCID50、1 TCID50、0.1 TCID50)和細胞對照。待測血清和病毒稀釋液混勻后，37℃孵育1 h，加入100μL濃度約為1×106個/mL的BHK-21細胞懸液。培養72 h后觀察CPE，按Karber法計算血清中和抗體滴度。