水貂腸道乳酸桿菌RSJ生長曲線及產酸、藥敏試驗結果（二）
1.2.8抑菌試驗
將致病性大腸桿菌和沙門氏菌分別接種于營養肉湯中，37℃，180 r/min過夜培養后，稀釋菌液濃度至0.5個麥氏比濁單位，將已滅菌的普通培養基加熱到完全融化，倒在培養皿內(每皿15 mL)，待其凝固。此外，將融化的普通培養基冷卻到50℃左右加入致病菌株，將混有菌的培養基5 mL加到已凝固的培養基上待其凝固。然后以無菌操作在培養基表面垂直放上牛津杯，輕輕加壓，使其與培養基接觸無空隙，在杯中加入乳酸菌發酵液。置于37℃培養16～18 h，然后用測量抑菌圈直徑，計算其平均值。
1.2.9安全性試驗
選取體重18～22 g的昆明系小白鼠10只，隨機分組，每組5只。按3.6×108CFU/mL的劑量對空腹8 h后的試驗小鼠每天每次經口灌胃0.3 mL，同時設空白對照組。每天觀察和記錄，14 d結束試驗后，剖檢觀察內臟及其它組織器官有無變化。
2結果
2.1菌落形態及鏡檢結果
菌落形態為中央凸起、邊緣整齊、黃色或白色半透明狀菌落。鏡檢為革蘭氏陽性菌，菌體形態為桿狀，多數呈鏈條狀排列(如圖1)，命名為RSJ。
2.2生化試驗鑒定結果
分離菌的觸酶試驗、吲哚試驗、硫化氫試驗、硝酸鹽還原試驗等皆為陰性(見表1)，根據RSJ菌的菌落、鏡檢形態和生化試驗，參照文獻初步鑒定為乳酸桿菌屬(Lactobacillus)。
圖1 RSJ的菌落形態與革蘭染色鏡檢(×1000)
2.3 PCR鑒定結果
用乳酸桿菌屬特異性引物對菌株RSJ進行PCR鑒定，瓊脂糖凝膠電泳結果顯示在223 bp處有特異性條帶(圖2)。
將分離的RSJ菌株的測序結果與其他17個從GenBank獲取的乳酸桿菌屬的核酸序列進行同源性比較。結果顯示比對的幾個菌株的同源性在91.2%～94.7%之間(圖3)，RSJ菌株被鑒定為乳酸桿菌屬。
2.4耐酸試驗結果
對RSJ菌株進行不同pH生長情況試驗，判定試驗結果標準是依據營養肉湯培養基底部是否有白色沉淀，如果有白色沉淀，搖動呈渾濁狀，說明菌株在此培養條件下能夠進行繁殖生長。結果表明，pH 2.0和3.0時，培養液搖勻后清澈，菌株在此pH基本不生長；pH 4.0時，培養液微混，菌株生長，但生長不好；pH 5.0和6.0時，培養液底部的有白色沉淀，搖勻后渾濁，菌株生長良好(圖4)。
表1 RSJ的生化試驗鑒定結果
2.5生長曲線和產酸試驗
由圖5看出，菌株RSJ在6 h開始進入對數期，前18 h菌株繁殖較快，OD600值持續生長，此時pH急速下降；從18～36 h，OD600值趨于平穩在1.670，pH趨于3.98，菌株維持在穩定期。
圖2菌株RSJ的16S rRNA基因PCR擴增結果
圖3 RSJ與其他菌株核酸序列的同源性比較結果
圖4菌株RSJ的耐酸試驗結果0.不接菌對照；2-6.不同pH培養基培養；7.接菌對照
2.6藥敏試驗結果
用標準敏感菌株金黃色葡萄球菌ATCC25923(S.aureusATCC25923)作為質控菌，試驗菌對抗生素的藥敏性參照WHO提供的NCCLS的標準進行判斷。對菌株進行了藥敏試驗，得到菌株對16種抗生素的藥敏結果見表2。由表2知，菌株RSJ對青霉素、慶大霉素和環丙沙星等有一定的耐藥性，其中對青霉素和環丙沙星的耐藥性較強，對其余抗生素則表現為敏感。
2.7抑菌試驗結果
菌株RSJ對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌均有抑菌作用，其中對金黃色葡萄球菌的抑菌圈為8.3 mm，對大腸桿菌的抑菌圈為9.5 mm。
圖5菌株RSJ的生長曲線和產酸曲線
2.8安全性試驗結果
經14 d灌服觀察，小鼠生長狀況良好，無死亡現象；剖檢內臟組織器官無肉眼可見異常變化，說明菌株RSJ對小鼠無毒性。
3討論
使用益生菌，首要問題是要考慮其定植性，活菌在體內定植是極為復雜的，具有宿主種屬特異性。所以，篩選菌種時，應盡量選用來自該動物屬宿主分離的正常菌群，這樣菌株進入動物體內才較易存活，并能與致病菌搶奪附著點，具有很強的競爭優勢。本試驗采取健康成年母貂的新鮮腸粘膜和糞便，利用改良MRS培養基進行培養，通過形態特征、生理生化反應，結合16S rRNA分子生物學鑒定，鑒定出1株乳酸桿菌RSJ，并對RSJ菌株的生長情況和安全性等生物特性進行了研究。
表2 RSJ的藥敏試驗結果
注：R.耐藥；M.中敏；S.敏感。
傳統的細菌鑒定方法試驗周期長、工作量大、試驗結果依賴人的主觀判斷。近年來，逐步建立起來的16S rRNA序列分析方法，通過提取樣品中微生物的總DNA，直接從核酸水平對樣品進行分析研究，為細菌的分類、鑒定提供了新的研究方法。據孫曉雯等報道，從豬糞便中分離得到一株新飼用乳桿菌，對其16S rDNA基因進行了測序并進行BLAST比對，和16S rDNA序列分析鑒定為約氏乳桿菌。陳麗園等通過對菌體形態特征、菌落特征和生理生化特性的分析，最終將1株抗雞沙門氏菌的乳酸菌歸類為乳酸乳桿菌亞軍。
從水貂體內分離到的菌種制成微生態制劑對促進水貂的生長會有較為明顯的效果。本試驗分離的菌株來自健康的水貂腸道，理論上講，能夠很好地適應水貂腸道。本試驗只對乳酸桿菌進行了屬的鑒定，還需要對其進行種鑒定，以及對其在水貂上的安全性試驗以及效果等方面有待于進一步研究。
4結論
從水貂腸道分離的1株優勢菌株(RSJ)，為乳酸桿菌屬。RSJ在10 h進入對數期，前22 h菌株繁殖較快，pH急速下降；22～36 h，菌株維持在穩定期；其對青霉素和環丙沙星的耐藥性較強；對小白鼠安全無毒，且對酸環境有一定的耐受性，其代謝產物對致病性大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均有抑制作用，具備了益生菌的基本條件。
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