基于革蘭氏陽(yáng)性菌生長(zhǎng)曲線(xiàn)等指標(biāo)評(píng)價(jià)纖維素基抑菌材料L-Met改性MCC（M-MCC）抑菌效果（五）
2.5 M-MCC對(duì)細(xì)胞膜通透性的影響
如圖9所示，與未處理的L.monocytogenes組相比，在1 MIC處理下，胞外電導(dǎo)率呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)，這種情況在2 MIC處理下表現(xiàn)得更加明顯。這是因?yàn)榛畹募?xì)菌細(xì)胞擁有完整的細(xì)胞膜，能夠選擇性的控制膜內(nèi)外的物質(zhì)跨膜運(yùn)輸，所以胞外電導(dǎo)率較為穩(wěn)定。而M-MCC處理過(guò)的L.monocytogenes、S.aureus胞外電導(dǎo)率上升，這說(shuō)明M-MCC可能改變了細(xì)胞膜的通透性，或是破壞了細(xì)菌細(xì)胞膜，從而導(dǎo)致細(xì)菌胞內(nèi)離子和聚合物轉(zhuǎn)移到懸液中，造成電導(dǎo)率的變化。
圖9 M-MCC處理對(duì)L.monocytogenes和S.aureus胞外電導(dǎo)率的影響
2.6 M-MCC對(duì)細(xì)胞內(nèi)容物的影響
核酸和蛋白質(zhì)是生物細(xì)胞的重要組成部分，一般情況下，核酸和蛋白質(zhì)等大分子不會(huì)跨過(guò)活細(xì)胞的細(xì)胞膜運(yùn)輸，因此，核酸和蛋白的泄漏情況可以一定程度上反映出細(xì)菌細(xì)胞膜的完整性。如圖10所示，經(jīng)過(guò)1 MIC和2 MIC處理后L.monocytogenes和S.aureus的OD260 nm和OD280 nm均有一定程度的上升，這說(shuō)明部分L.monocytogenes和S.aureus細(xì)胞的核酸和蛋白質(zhì)泄漏到上清液中，即M-MCC對(duì)細(xì)菌細(xì)胞膜的完整性產(chǎn)生了影響，使菌體細(xì)胞死亡，導(dǎo)致核酸和蛋白質(zhì)泄漏。各處理組均在反應(yīng)3 h左右核酸和蛋白的吸光度達(dá)到峰值，之后核酸和蛋白吸光度無(wú)明顯變化，即細(xì)菌的胞內(nèi)核酸和蛋白不再泄漏。所用M-MCC的濃度越高，上清液中核酸和蛋白質(zhì)檢出量越多，即對(duì)細(xì)菌細(xì)胞的破壞越嚴(yán)重。
圖10 M-MCC處理對(duì)L.monocytogenes（A）和S.aureus（B）細(xì)胞內(nèi)容物泄漏情況的影響
2.7 M-MCC對(duì)細(xì)胞DNA含量的影響
DAPI是一種能夠和DNA具有極強(qiáng)結(jié)合能力的熒光染料，能夠透過(guò)完整的細(xì)胞膜，因此一般用于活細(xì)胞的染色。利用DAPI的過(guò)膜能力，使之與L.monocytogenes活細(xì)胞的DNA相結(jié)合，觀察M-MCC對(duì)L.monocytogenes細(xì)胞DNA的影響。如圖11所示，對(duì)照組無(wú)處理的L.monocytogenes細(xì)胞熒光強(qiáng)度較強(qiáng)，而經(jīng)過(guò)1 MIC和2 MIC處理的細(xì)胞熒光強(qiáng)度明顯降低。這說(shuō)明經(jīng)過(guò)M-MCC處理的細(xì)胞DNA發(fā)生了泄漏，細(xì)胞內(nèi)DNA含量降低，這也與核酸泄漏情況相符合。
圖11 M-MCC處理后的L.monocytogenes激光共聚焦圖像
3結(jié)論
本研究成功制備了具有抑菌效果的M-MCC抑菌劑，用以應(yīng)對(duì)食品中L.monocytogenes和S.aureus的污染。通過(guò)SEM、EDS、FTIR、XPS、XRD和TGA表征改性后M-MCC的形貌變化、元素變化以及穩(wěn)定性，結(jié)果表明L-Met成功接枝。對(duì)M-MCC的體外抗氧化能力進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)其對(duì)ABTS陽(yáng)離子自由基有著良好的去除效果。而后通過(guò)MIC以及細(xì)菌生長(zhǎng)曲線(xiàn)進(jìn)行了M-MCC對(duì)L.monocytogenes和S.aureus抑菌效果的研究。確定了M-MCC對(duì)L.monocytogenes和S.aureus的MIC為15 mg/mL。細(xì)菌生長(zhǎng)曲線(xiàn)表明M-MCC能推遲指示菌的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。這可能與革蘭氏陽(yáng)性菌獨(dú)特的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)有關(guān)。通過(guò)研究細(xì)胞膜通透性、細(xì)胞膜完整性、細(xì)胞內(nèi)容物以及DNA含量等多個(gè)方面，分析了M-MCC對(duì)L.monocytogenes和S.aureus細(xì)胞膜的作用。相關(guān)結(jié)果表明，M-MCC處理對(duì)L.monocytogenes的生長(zhǎng)有顯著的抑制效果，相應(yīng)的胞外電導(dǎo)率、核酸和蛋白質(zhì)的含量都發(fā)生明顯的變化，且與處理時(shí)間的長(zhǎng)短密切相關(guān)。綜上，M-MCC可能是直接作用于L.monocytogenes的細(xì)胞膜表面，較低濃度的M-MCC可增加細(xì)菌細(xì)胞膜的通透性，破壞細(xì)菌胞內(nèi)外電解質(zhì)平衡，從而抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)；較高濃度的M-MCC則劇烈作用于細(xì)菌細(xì)胞膜表面，破壞細(xì)菌的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，使細(xì)胞死亡并釋放出原本胞內(nèi)的核酸和蛋白質(zhì)等大分子，從而起到抑菌的作用。表明M-MCC抗菌劑在抗菌應(yīng)用方面潛力巨大。
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