不同碳源、氮源和金屬離子對(duì)耐鋅菌株的生長(zhǎng)特性的影響（二）
2結(jié)果與分析
2.1耐鋅菌株HXZ-1的篩選
樣品經(jīng)過多次馴化培養(yǎng)后，吸取適量菌液稀釋涂布于含有800 mg/L ZnCl2的固體LB培養(yǎng)基上，于30℃下培養(yǎng)48 h，得到一株長(zhǎng)勢(shì)良好的菌株，編號(hào)為HXZ-1，在LB固體平板上生長(zhǎng)24 d后形成乳黃色、不透明、邊緣整齊、表面隆起、濕潤(rùn)光滑、易挑起的圓形菌落(如圖1-A和1-B)，革蘭氏染色為陽性(如圖1-C)，無鞭毛，不運(yùn)動(dòng)，不產(chǎn)芽孢。
2.2不同鋅離子濃度對(duì)菌株HXZ-1生長(zhǎng)的影響
通過菌株HXZ-1在不同濃度的鋅離子液體培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)狀況，了解菌株對(duì)不同鋅離子濃度的耐受性情況。如圖2所示，當(dāng)鋅離子濃度為1200 mg/L時(shí)，OD600為0，菌體生長(zhǎng)被完全抑制；當(dāng)鋅離子濃度為50 mg/L時(shí)，OD600最大，為0.895。從總體趨勢(shì)來看，隨著鋅離子濃度的逐漸增大，OD600的值先升高后降低。這說明，低濃度的鋅離子(50 mg/L)對(duì)菌株HXZ-1生長(zhǎng)均有刺激作用，而鋅離子濃度高于50 mg/L時(shí)會(huì)對(duì)菌株HXZ-1生長(zhǎng)有抑制作用，抑制作用隨濃度增加而增大。這可能是由于高濃度的鋅離子對(duì)菌株有一定的毒性，導(dǎo)致新陳代謝活性和生長(zhǎng)量降低[6]。據(jù)報(bào)道，菌株耐鋅濃度為1～10 mmol/L時(shí)為中度耐鋅細(xì)菌，而耐鋅濃度超過10 mmol/L為抗鋅細(xì)菌[18]，菌株HXZ-1能耐受鋅離子的最高濃度為1000 mg/L，因此可以判斷出菌株HXZ-1為抗鋅細(xì)菌。
圖1菌株HXZ-1在LB固體培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)(A)及其革蘭氏染色(B)的結(jié)果
圖2不同鋅離子濃度對(duì)菌種HXZ-1生長(zhǎng)的影響
2.3 16S rRNA基因擴(kuò)增
菌株HXZ-1的基因組DNA提取結(jié)果見圖3，基因組DNA在電泳圖上的23 130 bp附近一條明顯的條帶，可以用于PCR擴(kuò)增，16S rRNA序列擴(kuò)增長(zhǎng)度為1500 bp左右。
2.4 16S rRNA基因序列的測(cè)定及系統(tǒng)發(fā)育分析
根據(jù)16S rRNA基因的測(cè)序結(jié)果，將其序列與EzTaxon-e server(http://eztaxon-e.ezbiocloud.net/)數(shù)據(jù)庫中16S rRNA基因序列進(jìn)行同源性比較，選擇其中的12株菌的16S rRNA基因序列用于系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析，采用CLUSTAL_X將菌株XHZ-1的16S rRNA基因序列與其同源關(guān)系相近的序列比對(duì)分析后[19]，把兩頭的序列剪切整齊，用MEGA version 5.0軟件包中的Kimura-Parameter Distance模型計(jì)算進(jìn)化距離，用Neighbor-Joining構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹[20]，1000次隨機(jī)抽樣，計(jì)算自引導(dǎo)值(Bootstrap)以評(píng)估系統(tǒng)進(jìn)化樹的置信度。結(jié)果如圖4，菌株HXZ-1所得16S rRNA基因序列與其序列相近的菌株都在Promicromonospora屬，與模式菌株P(guān)romicromonosporaflavaCC 0387T具有最高的相似性為98.46%，結(jié)合前述的菌株形態(tài)特征，可以鑒定該菌株HXZ-1為原小單孢菌屬(Promicromonosporasp.HXZ-1)。
圖3菌株HXZ-1的基因組DNA、16S rRNA基因的PCR擴(kuò)增
圖4菌株HXZ-1的系統(tǒng)發(fā)育分析
2.5菌株HXZ-1對(duì)不同碳源利用試驗(yàn)
不同碳源對(duì)菌株HXZ-1生長(zhǎng)影響的結(jié)果如圖5所示。不同的微生物利用糖、醇、有機(jī)酸、脂肪酸等的能力有很大的差異，這是菌株鑒定中的一項(xiàng)重要指標(biāo)。在以NH4NO3作氮源的情況下，供試的8種碳源中：菌株HXZ-1對(duì)葡萄糖、甘露醇和蔗糖的利用較好，其中對(duì)葡萄糖利用最好，OD600值最大，為0.771；對(duì)淀粉、阿拉伯糖和麥芽糖利用較差，說明菌株HXZ-1的最適碳源為葡萄糖。
圖5不同碳源對(duì)菌株HXZ-1生長(zhǎng)的影響
2.6菌株HXZ-1對(duì)不同氮源利用試驗(yàn)
不同氮源對(duì)菌株HXZ-1生長(zhǎng)影響的結(jié)果如圖6所示。不同的微生物利用氮源的能力有很大的差異，也是菌株鑒定中的一項(xiàng)重要指標(biāo)。在以葡萄糖作碳源的情況下，供試的7種氮源中：菌株HXZ-1對(duì)2種有機(jī)氮源蛋白胨、酵母粉利用較好，而對(duì)硝酸鈉和亞硝酸鈉的利用較差，當(dāng)?shù)鞍纂俗鳛榈磿r(shí)，OD600值最大，為0.728；說明菌株HXZ-1的最適氮源為蛋白胨。
圖6不同氮源對(duì)菌株HXZ-1生長(zhǎng)的影響
2.7菌株HXZ-1對(duì)不同濃度鋅離子的吸附試驗(yàn)
菌株HXZ-1對(duì)不同濃度鋅離子的吸附率如圖7所示。微生物對(duì)不同濃度的金屬離子的吸附能力有很大的差異。從總體趨勢(shì)來看，隨著鋅離子濃度的增大，菌株HXZ-1對(duì)鋅離子的吸附率先升高后降低。在0～50 mg/L，隨著鋅離子濃度的增加，菌株HXZ-1對(duì)鋅離子的吸附率呈上升趨勢(shì)；當(dāng)鋅離子濃度大于50 mg/L時(shí)，吸附率逐漸減小，當(dāng)大于200～1000 mg/L之間，吸附率較低。當(dāng)鋅離子濃度為50 mg/L時(shí)，菌株HXZ-1對(duì)鋅離子的吸附率最大，為29.1%，這可能與菌株HXZ-1在含有50 mg/L的LB培養(yǎng)基中生長(zhǎng)良好有關(guān)。
2.8菌株HXZ-1在不同時(shí)間內(nèi)對(duì)鋅離子的吸附試驗(yàn)
微生物在不同生長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)對(duì)金屬離子的吸附能力有很大的差異，在培養(yǎng)體系中鋅離子濃度為500 mg/L時(shí)仍能生長(zhǎng)的細(xì)菌，被認(rèn)為是耐鋅性較強(qiáng)的微生物[18]。當(dāng)鋅離子濃度為500 mg/L時(shí)，菌株HXZ-1在不同培養(yǎng)時(shí)間對(duì)鋅吸附率的結(jié)果如圖9所示。總的來看，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，菌株HXZ-1對(duì)鋅離子的吸附率先升高后降低。該菌株HXZ-1在0～4 h內(nèi)，吸附率上升趨勢(shì)較慢；在4～10 h內(nèi)，吸附率上升趨勢(shì)較快；當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間大于10 h時(shí)，菌株HXZ-1對(duì)鋅離子的吸附率開始下降。試驗(yàn)表明，當(dāng)菌株HXZ-1的培養(yǎng)時(shí)間為10 h時(shí)，菌株HXZ-1對(duì)鋅離子的吸附率最大，為18.8%。
圖7培養(yǎng)基中不同鋅濃度時(shí)菌體HXZ-1對(duì)鋅吸附率的影響
圖8菌株HXZ-1在不同培養(yǎng)時(shí)間對(duì)Zn2+吸附率的影響
3結(jié)論
本研究從某造紙廠的污水中篩選到一株對(duì)鋅具有抗性的菌株HXZ-1，對(duì)其進(jìn)行生理生化研究和系統(tǒng)發(fā)育分析，將其鑒定為原小單孢菌屬(Promicromonosporasp.HXZ-1)。當(dāng)前，抗鋅菌株報(bào)道較多，主要在Aspergillus,Penicillium,Sphingomonas,Streptomyces和Verticillium等屬[5-9,21]，尚未在Promicromonospora屬有抗鋅菌株的報(bào)道。因此，Promicromonospora屬抗鋅菌株的分離，為鋅污染區(qū)域的微生物修復(fù)提供了新的菌種資源。
菌株HXZ-1在鋅離子濃度為50 mg/L的LB培養(yǎng)基中生長(zhǎng)良好，能耐受鋅離子的最高濃度為1000 mg/L。菌株HXZ-1在葡萄糖為碳源、蛋白胨為氮源生長(zhǎng)最好。當(dāng)菌株HXZ-1在此最優(yōu)培養(yǎng)條件下生長(zhǎng)，鋅離子濃度為50 mg/L時(shí)，菌株HXZ-1對(duì)鋅離子的吸附率最大，為29.1%；當(dāng)鋅離子濃度為500 mg/L時(shí)，培養(yǎng)時(shí)間為10 h時(shí)，菌株HXZ-1對(duì)鋅離子的吸附率最大，為18.8%。因此，菌株HXZ-1是一株對(duì)鋅有較強(qiáng)抗性和吸附性的細(xì)菌，在重金屬鋅污染區(qū)域的微生物修復(fù)中有著良好的應(yīng)用潛力。
不同碳源、氮源和金屬離子對(duì)耐鋅菌株的生長(zhǎng)特性的影響（一）
不同碳源、氮源和金屬離子對(duì)耐鋅菌株的生長(zhǎng)特性的影響（二）
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