轉(zhuǎn)錄水平解析昆蟲病原線蟲共生菌菌株新型殺菌蛋白PPIA-L20基因表達(dá)調(diào)控——結(jié)果與分析
2 結(jié)果與分析
2.1 不同發(fā)酵時間ppia-l20基因的表達(dá)變化
分別取4～84 h不同發(fā)酵時間點的NN6菌株的菌體細(xì)胞，提取Total RNA進(jìn)行6次實時熒光定量PCR測定，結(jié)果(圖1)表明ppia-l20相對表達(dá)水平極不穩(wěn)定且趨勢多樣，即使是使用同一內(nèi)參基因16S rRNA。選取16S rRNA和ropB兩種內(nèi)參基因，共同定量得到相似基因表達(dá)趨勢的8和12 h 2個時間點的菌株進(jìn)行后續(xù)的轉(zhuǎn)錄組測序(圖1-F)。
圖1 不同發(fā)酵時間ppia-l20基因的表達(dá)水平
2.2 Xenorhabdus bovienii NN6發(fā)酵時間與菌體總數(shù)、活菌數(shù)、基因相對表達(dá)水平相關(guān)性分析
從圖2可知，隨著發(fā)酵時間的延長，菌體量逐漸增加。從表3可見，對數(shù)期活菌數(shù)與菌體總數(shù)(D600表示)與發(fā)酵時間成正相關(guān)，說明隨著發(fā)酵時間的延長，對數(shù)期的菌體大量繁殖，但與ppia-l20基因表達(dá)水平無相關(guān)性。
圖2 發(fā)酵過程中菌體量變化
表3 對數(shù)期活菌數(shù)、菌體總數(shù)、ppia-l20基因相對表達(dá)情況相關(guān)性分析
2.3 RNA-Seq測序數(shù)據(jù)質(zhì)量分析
對8和12 h 2組不同發(fā)酵時間菌體細(xì)胞共6個樣本進(jìn)行高通量測序，并對測序質(zhì)量進(jìn)行統(tǒng)計分析。結(jié)果(表4)顯示:原始測序序列(raw reads)去除帶接頭序列、空序列及低質(zhì)量測序序列后分別得到15 352 102、14 498 440、18 087 468、15 466 120、15 821 766、16 257 026條純凈序列(clean reads)，堿基GC含量平均為48.86%，低質(zhì)量堿基測序序列(<Q20)占原始序列的比例很低，而高質(zhì)量堿基序列(≥Q20)平均比例達(dá)到98.18%，說明測序數(shù)據(jù)的堿基組成情況和質(zhì)量良好。將過濾后的測序序列比對到參考基因組上，發(fā)現(xiàn)測序序列均勻覆蓋在參考基因組上，能定位到基因組上測序序列的平均比例達(dá)87.89%。這些結(jié)果表明此次測序序列的整體質(zhì)量良好，測序數(shù)據(jù)隨機(jī)性良好，可用于后續(xù)的分析。
表4 測序數(shù)據(jù)質(zhì)量統(tǒng)計
2.4 Xenorhabdus bovienii NN6兩組間差異表達(dá)基因(DEG)分析
以發(fā)酵8 h菌體中的基因表達(dá)水平為參照，利用DESeq2(V1.6.3)分析發(fā)酵12 h菌體中差異表達(dá)的基因，設(shè)置篩選閾值 P<0.05，log2(Fold change)>1，構(gòu)建火山圖(圖3-A)。RNA-seq共檢測到2 716個基因，其中466個DEG，基因組占比17.2%，其中193個DEG上調(diào)，273個DEG下調(diào)。DEG的熱圖聚類分析表明重復(fù)組內(nèi)基因表達(dá)趨勢基本相同，組間差異顯著(圖3-B)。
圖3 Xenorhabdus bovienii NN6兩組間差異表達(dá)基因
2.5 RT-qPCR驗證轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)
隨機(jī)選取8個DEG(包括4個上調(diào)基因和4個下調(diào)基因)和2個表達(dá)差異不顯著的基因，Real-time PCR驗證結(jié)果(圖4)顯示基因表達(dá)趨勢與測序數(shù)據(jù)結(jié)果一致，說明RNA-seq轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果數(shù)據(jù)可靠。
圖4 RNA-seq數(shù)據(jù)與RT-qPCR比對
2.6 Xenorhabdus bovienii NN6兩組間GO富集分析
進(jìn)一步對8和12 h 2組中的DEG進(jìn)行GO注釋分析，結(jié)果(圖5)顯示有442個DEG注釋到生物學(xué)過程、細(xì)胞組分和分子功能大類的31個功能小類中。分子功能分類中含有最多的差異基因，分子功能中差異基因主要?dú)w屬于雜環(huán)化合物結(jié)合、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子活性、氮化合物代謝和轉(zhuǎn)移酶活性等。生物學(xué)功能和細(xì)胞組分分類中的差異基因數(shù)量少于分子功能分類，生物學(xué)過程中差異基因主要富集在代謝過程和應(yīng)激反應(yīng)。值得注意的是，細(xì)胞組分分類中僅富集到2個功能小類，主要?dú)w屬于細(xì)胞和膜部分，與細(xì)胞膜的功能相關(guān)。這表明Xenorhabdus bovienii NN6菌株可能在發(fā)酵過程中代謝活躍，ppia-l20表達(dá)量變化可能與轉(zhuǎn)移酶活性和膜蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)過程有關(guān)。
為了探究DEG在ppia-l20基因表達(dá)變化中的潛在功能，對所有DEG進(jìn)行GO富集分析，分別統(tǒng)計生物過程(BP)、細(xì)胞成分(CC)和分子功能(MF)3個分類富集程度前10的GO條目，圖6結(jié)果表明在這30個GO條目中，差異表達(dá)基因在生物過程中主要富集于細(xì)胞膜(membrane)、定位(localization)、水解酶(hydrolase activity)、膜整體成分(integral component of membrane)、膜內(nèi)成分(intrinsic component of membrane)、轉(zhuǎn)運(yùn)活性(transporter activity)。其中細(xì)胞膜(membrane)的富集率最高為77.5%，表明在發(fā)酵過程中Xenorhabdus bovienii NN6菌株與膜相關(guān)GO條目中的77.5%的基因差異表達(dá)，提示發(fā)酵過程中ppia-l20基因表達(dá)升高可能與細(xì)胞膜功能相關(guān)蛋白的表達(dá)密切相關(guān)。
圖5 Xenorhabdus bovienii NN6兩組間差異表達(dá)基因的GO注釋分類圖
圖6 Xenorhabdus bovienii NN6組間差異表達(dá)基因各分類前10的GO富集分析
2.7 Xenorhabdus bovienii NN6兩組間DEG的KEGG富集分析
KEGG注釋結(jié)果(圖7)顯示，有191個DEG注釋到了62個KEGG代謝通路。基于KEGG數(shù)據(jù)庫(https://www.kegg.jp/kegg/pathway.html)進(jìn)行通路分析，其中13條通路的可信度顯著(P<0.05)。上調(diào)基因主要富集在次級代謝產(chǎn)物合成、氨基酸合成、雙組分調(diào)節(jié)系統(tǒng)相關(guān)通路; 下調(diào)基因主要富集在次級代謝產(chǎn)物合成相關(guān)通路、鞭毛組裝與磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)相關(guān)通路。
圖7 Xenorhabdus bovienii NN6差異表達(dá)基因前20的KEGG富集分析
2.8 KEGG關(guān)鍵通路中代表性DEG分析
從表5可知，參與雙組分調(diào)節(jié)系統(tǒng)共有14個DEG，其中12個表達(dá)上調(diào)2個表達(dá)下調(diào)。ompR基因編碼的轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白OmpR是雙組分調(diào)節(jié)系統(tǒng)的關(guān)鍵蛋白，qseC基因編碼雙組分傳感器激酶N端結(jié)構(gòu)。目的基因ppia-l20位于陽離子抗菌肽抵制通路中，位于同一條通路上的3個基因中，arnF和eamA編碼的蛋白屬于DUF6轉(zhuǎn)錄因子家族，其表達(dá)上調(diào)，另一個基因nlpE負(fù)責(zé)編碼外膜脂蛋白，參與銅離子的攝取和黏附功能，其表達(dá)下調(diào)。
表5 關(guān)鍵通路中代表性差異基因表達(dá)情況
2.9 PPIA-L20相關(guān)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析
通過STRING對PPIA-L20蛋白進(jìn)行蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，以獲取其潛在蛋白的互作關(guān)系，如圖8所示，PPIA-L20可能與AMPs結(jié)合蛋白TycC、GrsB、ATP酶HtpG、酮酰合成酶N端PpsE蛋白等蛋白相互作用，AMPs結(jié)合蛋白TycC、GrsB定位于細(xì)胞外膜，用于識別外界AMPs結(jié)合信號，ATP酶HtpG和酮酰合成酶N端PpsE蛋白參與細(xì)胞的能量代謝過程。
GO富集分析表明，ppia-l20基因變化與細(xì)胞膜的變化、轉(zhuǎn)移酶活性、代謝過程相關(guān)，KEGG通路分析預(yù)測，PPIA-L20蛋白位于陽離子抗菌肽抵抗通路，與雙組分調(diào)節(jié)系統(tǒng)、磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)活動相關(guān); 與PPIA-L20蛋白位于共同通路(陽離子抗菌肽抵抗通路)的nlpE基因表達(dá)的外膜脂蛋白NlpE屬于DUF6轉(zhuǎn)錄因子家族，NlpE蛋白與雙組分調(diào)節(jié)系統(tǒng)中的cpxR基因、cpxA基因表達(dá)的蛋白具有互作關(guān)系。在腸桿菌科中，控制AMPs耐藥性的基因通常受雙組分信號通路以及磷酸轉(zhuǎn)移系統(tǒng)的控制，NlpE蛋白同時存在于PPIA-L20蛋白共同通路(陽離子抗菌肽抵抗通路)的上游，可能起到調(diào)控ppia-l20基因表達(dá)的作用，該蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建為調(diào)控機(jī)制的推測提供線索。
圖8 蛋白互作的網(wǎng)絡(luò)預(yù)測
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