生食大眼金槍魚中生物胺產(chǎn)生菌分離純化、菌落總數(shù)、生長曲線及形狀鑒定（二）
1.3.4菌株的分離純化
參考吳燕燕等的方法，無菌條件下取0℃貯藏12 d的5 g魚肉于45 mL無菌生理鹽水中，制備為10-1樣液，依次梯度稀釋到10-2、10-3、10-4和10-5后，各取100μL菌液涂布到生物胺初篩培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)3 d。
挑取藍(lán)紫色菌落在TSA培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)至出現(xiàn)單菌落，30℃培養(yǎng)3 d。
將單菌落劃線接種于TSA斜面培養(yǎng)基上富集培養(yǎng)，并于菌種保藏箱中臨時保藏。
1.3.5生長曲線的測定
參考AYYASH等的方法，將分離純化的菌落接種于TSB培養(yǎng)基中活化培養(yǎng)，每間隔相同時間用Biosense自動生長曲線分析系統(tǒng)連續(xù)測定培養(yǎng)液的OD605nm值，觀察菌株的生長情況。
1.3.6生物胺質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測定
參考趙慶志等的衍生方法略有改動，將單菌落接種于TSB培養(yǎng)基中活化培養(yǎng)，30℃培養(yǎng)3 d，各取1 mL活化菌液離心，取上清液，對上清液進行衍生處理。
色譜條件參考GB5009.208—2016的方法。色譜柱：WondaCract ODS-2色譜柱(4.6 mm×250 mm，5μm)，柱溫40℃，流速0.8 mL/min，進樣量10μL，檢測波長254 nm。流動相A為含1%甲酸的0.01 mol/L乙酸銨溶液，流動相B為乙腈，梯度洗脫程序為：0～22 min，B=58%(體積分?jǐn)?shù))；22～25 min，B=78%(體積分?jǐn)?shù))；25～32.01 min，B=90%(體積分?jǐn)?shù))；32.01～37 min，B=58%(體積分?jǐn)?shù))，外標(biāo)法定量。標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程如表1所示。
表1標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程
1.3.7形態(tài)學(xué)指標(biāo)
觀察并記錄TSA上單菌落形態(tài)特征，挑取單菌落進行涂片、革蘭氏染色，于顯微鏡下觀察并記錄其大小、顏色、形狀、排列等。
1.3.8菌種鑒定
1.3.8.1生理生化實驗鑒定
吸取適量的菌液分別與3 mL 0.45%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))NaCl生理鹽水混勻，配制相當(dāng)于0.50～0.63麥?zhǔn)蠁挝坏木鷳乙海褂肰ITEK 2全自動微生物分析系統(tǒng)進行菌種鑒定。
1.3.8.2產(chǎn)生物胺細(xì)菌的16S rDNA鑒定
篩選出產(chǎn)胺量最高的菌株進行DNA提取，將PCR擴增產(chǎn)物進行凝膠電泳分析，送與測序公司進行測序，將返回的序列進行比對。
2結(jié)果與分析
2.1菌落總數(shù)和K值測定結(jié)果
將大眼金槍魚生魚片置于0℃下貯藏，結(jié)果如圖1所示。魚肉中菌落總數(shù)的變化情況由圖1-a可知，大眼金槍魚初始菌落總數(shù)為2.46 lgCFU/g，菌落總數(shù)初期生長緩慢，第4天達(dá)到4.45 lgCFU/g，超過生食金槍魚SC/T 3117—2006規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)，第12天時菌落總數(shù)為7.13 lgCFU/g，之后菌落長勢趨于平緩。K值是反映水產(chǎn)品鮮度的一個重要指標(biāo)，可以明確表明魚肉的新鮮程度。一般認(rèn)為，K值低于20%為一級鮮度，20%～40%為二級鮮度，大于70%已為腐敗。由圖1-b可知，魚肉初始K值為12.1%，第4天超過20%，不能用于制作生魚片，K值增長速度為3.30%/d。為更加準(zhǔn)確分離出生物胺產(chǎn)生菌，該實驗選擇菌落總數(shù)達(dá)到相對穩(wěn)定階段12 d的魚肉作為實驗樣品。
a-0℃下菌落總數(shù)的變化;b-0℃下K值的變化圖1 0℃下菌落總數(shù)和K值變化
2.2生物胺產(chǎn)生菌的分離純化
典型的產(chǎn)胺菌在生物胺篩選培養(yǎng)基中顯示藍(lán)紫色，其原理是微生物利用培養(yǎng)基中的游離氨基酸生成了堿性生物胺，從而使菌落周圍環(huán)境的pH值上升，溴甲酚紫指示劑顯示為藍(lán)紫色。挑取藍(lán)紫色菌落劃線接種于TSA培養(yǎng)基上純化培養(yǎng)，最終得到9株單菌落，編號為B-1～B-9。
2.3生物胺產(chǎn)生菌的生長曲線
將9株生物胺產(chǎn)生菌分別接種于TSB培養(yǎng)基中，確定9株細(xì)菌在0和30℃條件下的生長曲線，結(jié)果如圖2所示。9株菌株在0℃下生長緩慢，48 h后進入生長穩(wěn)定期。而在30℃下培養(yǎng)9株菌，對數(shù)生長期為4～12 h，之后進入生長穩(wěn)定期。結(jié)果表明，從大眼金槍魚中分離得到的9株菌株適宜在較高溫度下生長，初步鑒定為嗜溫菌(25～40℃)。
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