鐵皮、疊鞘石斛提取物對沙門氏菌生長狀況、群體運動的影響——摘要、材料與設備
摘 要 傳統抑菌劑的泛用使細菌表現出日趨嚴重的耐藥性,以群體感應系統為靶點的新型抑菌劑具有不使細菌產生耐藥性的優勢。該研究旨在為開發天然產物作為新型抑菌劑提供理論支持。以沙門氏菌為受試菌株,測定鐵皮、疊鞘石斛提取物對沙門氏菌的最小抑菌濃度(minimum inhibitory concentration,MIC),通過生長曲線實驗、泳動實驗和生物膜實驗研究提取物對沙門氏菌生長狀況、運動能力和生物膜生成能力的影響,通過HPLC分析提取物中的主要成分,通過分子對接模擬探究提取物對沙門氏菌群體感應系統的作用機制。結果顯示,鐵皮石斛提取物的MIC為8 mg/mL,疊鞘石斛提取物的MIC為4 mg/mL,在亞抑菌濃度下,沙門氏菌的生長不受影響,但運動能力和產生物膜能力均受到抑制(P<0.05),抑制效果呈現劑量依賴性,2種提取物均含有異鼠李素、金絲桃苷、槲皮素這3種單體成分,活性單體均能與LuxS蛋白相結合,提示提取物通過活性單體與受體蛋白結合來抑制致病因子表達實現抑菌作用。
沙門氏菌是常見的腸道致病菌,常引起人、食品和動物之間的循環感染,并呈現全球分布。近年來隨著抑菌劑的泛用,沙門氏菌的耐藥性和抗性問題日趨嚴重。群體感應(quorum sensing,QS)是細菌產生QS信號分子并釋放至胞外環境中,當環境中的信號分子濃度達到一定閾值,就能與相應受體蛋白結合,激活靶基因表達,調控菌體的群體行為。研究表明,沙門氏菌的QS系統可分為3類:酰基高絲氨酸內酯(acyl-homoserine lactone, AHL)介導的Ⅰ型系統、LuxS介導的Ⅱ型系統和AI-3/Epi/NE介導的Ⅲ型系統。沙門氏菌通過SdiA(suppressor of celldivision inhibition A)受體蛋白識別外環境中其他細菌產生的AHL信號分子生成SdiA-AHL復合體激活rck操縱子基因座表達,而rck操縱子正是沙門氏菌菌毛合成,增強抵抗血清抗體和生物膜形成的基因座。LuxS是一種小分子金屬酶,其作用是催化細菌活化甲基化循環的最后一步S-核糖高半胱氨酸轉化為4,5-二羥基-2,3-戊二酮(4,5-dihydroxy-2,3-pentandione,DPD),DPD能與水反應生成QS信號分子AI-2的前體,環境中的AI-2進入沙門氏菌細胞后,會激活沙門氏菌的鞭毛基因和相關毒力基因的表達。AI-3由胃腸道菌群產生,盡管AI-3不直接依賴于LuxS合成,但是LuxS突變對AI-3的產生會造成影響。綜上可知沙門氏菌的QS系統主要由LuxS蛋白調控,沙門氏菌毒力因子的表達受QS系統影響。因此研究基于QS系統的新型沙門氏菌抑菌劑,對緩解目前沙門氏菌耐藥性和抗性嚴重的局面有積極作用。
群體感應抑制劑(quorum sensing inhibitor,QSI)是在不抑制細菌正常生長的條件下通過抑制QS系統調控細菌生理活動,從而降低細菌致病力和侵襲力的物質。許多細菌的毒力因子(毒素、蛋白酶和免疫逃避因子)受QS系統的AHL信號分子調控,使得靶點QS開發新型抑菌劑有望成為破除沙門氏菌對越來越多抗生素耐藥局面的方式。與細菌耐藥性密切相關的生物膜形成過程與受QS系統調控的生物發光、毒力因子合成等過程具有進化上的相關性,靶向QS干擾旨在降低毒力并抑制生物膜,但并不殺死細菌,故而與傳統抗生素相比,它不會施加選擇性壓力,因此不太可能使細菌產生耐藥性。近年來,鑒于天然產物具有安全、低毒和來源廣泛的特點,將天然產物作為QSI已成為研究熱點。研究證明植物來源的天然產物中發揮抗QS系統活性的物質多為黃酮類化合物,而主產于四川、云南、貴州等地的石斛正含有多種黃酮類單體。鐵皮石斛和疊鞘石斛是主要的川產石斛品種,大力發展石斛種植基地是夾江縣重要的鄉村振興戰略,對石斛提取物功能活性的研究為進一步探索鐵皮石斛和疊鞘石斛的市場價值提供實驗基礎和理論支撐。
1 材料與設備
1.1 材料
受試菌株人腸道沙門氏菌,成都醫學院公共衛生學院實驗中心保存;鐵皮石斛干莖和疊鞘石斛干莖,夾江縣秧花石斛種植專業合作社。
1.2 試劑
瓊脂、LB肉湯培養基,北京索萊寶科技有限公司;甲醇、乙腈、甲酸,均為LC-MS級,上海麥克林生化科技股份有限公司。
泳動培養基(g/L):胰蛋白胨10,NaCl 5,瓊脂5,葡萄糖5。
1.3 儀器
SW-CJ-1FD-Ⅱ超凈工作臺,蘇州安泰空氣技術有限公司;BPH-9082恒溫培養箱,致微(廈門)儀器有限公司;WMLL-125B干熱滅菌箱,上海龍躍儀器設備有限公司;1510多功能酶標儀,德國PerkinElmer公司;5415R高速冷凍離心機,安徽中科中佳科學儀器有限公司;SR3000系列高效液相色譜儀,安徽皖儀科技股份有限公司;丹麥Biosense微生物生長動態監測系統。
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