利用細(xì)菌生長(zhǎng)曲線表征芳樟醇對(duì)三文魚莓實(shí)假單胞菌MS 02的抑菌效果（一）
高通量測(cè)序（high-throughput sequencing，HTS）能直接從樣品中提取DNA，并同時(shí)對(duì)數(shù)百萬(wàn)個(gè)基因樣本進(jìn)行測(cè)序分析，有效地避免了傳統(tǒng)微生物分離、培養(yǎng)的繁瑣過(guò)程和可能造成的污染。HTS在檢測(cè)不可培養(yǎng)微生物和低豐度微生物方面有其獨(dú)到之處，為全面描述細(xì)菌群落動(dòng)態(tài)、分析微生物代謝途徑與腐敗菌之間的相關(guān)性提供了可靠的方法。與傳統(tǒng)的Sanger法測(cè)序相比，HTS耗時(shí)更短、精準(zhǔn)度更高、且成本更為低廉。目前，HTS已應(yīng)用于食品領(lǐng)域的許多研究中，如傳統(tǒng)發(fā)酵鲅魚、雞肉、豬肉等。Cai Luyun等利用微波或遠(yuǎn)紅外解凍紅鯛魚片并研究解凍技術(shù)對(duì)微生物多樣性的影響，發(fā)現(xiàn)解凍方式對(duì)微生物優(yōu)勢(shì)菌群影響較小，貯藏前期假單胞菌屬是其主要菌屬，貯藏24 h以后，芽孢桿菌的比例顯著增加，也成為紅鯛魚片的優(yōu)勢(shì)菌群。
芳樟醇是一些芳香植物精油，如薰衣草精油、芳樟精油的主要成分之一，常被作為芳香劑和調(diào)味劑添加到洗滌劑和食品中，每年全球總消費(fèi)量超過(guò)1 000 t。芳樟醇還被美國(guó)食品和藥品管理局歸類為“公認(rèn)安全”（generally recognized as safe，GRAS）物質(zhì)，聯(lián)合國(guó)糧食及農(nóng)業(yè)組織/世界衛(wèi)生組織食品添加劑聯(lián)合專家委員會(huì)確定了芳樟醇的每日允許攝入量（acceptable daily intake，ADI）為0～0.5 mg/kgmb。芳樟醇除了簡(jiǎn)單的調(diào)香調(diào)味功能之外，還具有抗菌、抗炎癥、抗腫瘤、抗高血壓、預(yù)防神經(jīng)退行性疾?。ò柎暮Ｄ〉龋┑裙πА?
莓實(shí)假單胞菌（Pseudomonas fragi）廣泛存在于各種冷藏食品中，已有大量文獻(xiàn)報(bào)道莓實(shí)假單胞菌是肉品、海產(chǎn)品和乳制品中的優(yōu)勢(shì)腐敗菌，極易導(dǎo)致食品腐敗變質(zhì)，且隨著時(shí)間的推移，莓實(shí)假單胞菌在食品菌相體系中的優(yōu)勢(shì)地位更加明顯。鑒于前人對(duì)莓實(shí)假單胞菌的研究較少，且相關(guān)研究大多集中于畜禽肉類，水產(chǎn)品尤其是三文魚中莓實(shí)假單胞菌的相關(guān)報(bào)道較少見(jiàn)，且鮮有探究芳樟醇對(duì)三文魚源莓實(shí)假單胞菌的抑菌活性及機(jī)理的研究，因此，本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用HTS分析不同貯藏期三文魚的菌相變化，再以提取自三文魚中的莓實(shí)假單胞菌MS 02為靶細(xì)菌，研究芳樟醇對(duì)其抑菌性能及作用機(jī)制。
本研究利用細(xì)菌生長(zhǎng)曲線表征芳樟醇對(duì)莓實(shí)假單胞菌的抑菌效果，通過(guò)掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope，SEM）觀察菌體的微觀形態(tài)變化，通過(guò)測(cè)定細(xì)菌細(xì)胞膜的通透性、完整性、菌體內(nèi)堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，AKP）和鈉鉀ATP酶活力來(lái)分析芳樟醇的抗菌機(jī)制，為芳樟醇作為天然抑菌劑對(duì)三文魚保鮮提供理論依據(jù)。
1材料與方法
1.1材料與試劑
三文魚購(gòu)自遼寧省大連市麥德龍水產(chǎn)市場(chǎng)，原產(chǎn)地法羅群島。
芳樟醇（純度大于98%）上海源葉生物科技有限公司；TaqPCR Master Mix試劑盒上海生工生物工程有限公司；AKP測(cè)試盒、超微量ATP酶（Na＋K＋-ATP酶）測(cè)試盒南京建成生物工程研究所；二乙酸熒光素（fluorescein diacetate，F(xiàn)DA）上海阿拉丁生化科技股份有限公司；平板計(jì)數(shù)瓊脂（plate count agar，PCA）培養(yǎng)基、LB肉湯青島海博生物科技有限公司；磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）（pH 7.2、1×）、戊二醛北京索萊寶生物科技有限公司；氨芐青霉素國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；甲醇天津福晨化學(xué)試劑有限公司。
1.2儀器與設(shè)備
SW-CJ-2FD超凈工作臺(tái)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；LRH-250A生化培養(yǎng)箱上海一恒科技有限公司；Victor X3酶標(biāo)儀美國(guó)Perkin Elmer公司；Legend Micro21R微量冷凍離心機(jī)美國(guó)賽默飛世爾科技公司；MS-105DU電子分析天平、LE703電導(dǎo)率儀瑞士梅特勒托利多儀器有限公司；cs 150 gx3超速離心機(jī)、F7000熒光分光光度計(jì)日本日立公司；MLS-3030CH立式高壓蒸汽滅菌鍋日本三洋公司；THZ-D臺(tái)式恒溫振蕩箱太倉(cāng)市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠；SCIENTA-IID超聲波細(xì)胞粉碎器寧波新芝生物科技公司。
1.3方法
1.3.1三文魚樣品的預(yù)處理和高通量測(cè)序
三文魚捕撈后立即宰殺放血去內(nèi)臟，經(jīng)液氮速凍后空運(yùn)至遼寧，取三文魚腹部魚肉，干冰冷凍保藏運(yùn)輸至本實(shí)驗(yàn)室。將三文魚分割成若干個(gè)質(zhì)量為10 g的魚塊（2 cmh2 cmh2 cm），放入無(wú)菌培養(yǎng)皿內(nèi)，用3層保鮮膜密封，置于冰箱內(nèi)于4℃下保存，分別于第0、3、6、9、12天取樣，樣品取出后立刻放入－80℃冰箱中保存，取樣結(jié)束后將樣品送至天津諾禾致源生物信息科技有限公司進(jìn)行HTS分析，樣品在干冰環(huán)境中貯運(yùn)。樣品經(jīng)過(guò)DNA提取、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增及純化、系統(tǒng)數(shù)據(jù)庫(kù)的建立及測(cè)序后，得到原始數(shù)據(jù)，處理后得到有效數(shù)據(jù)，基于有效數(shù)據(jù)進(jìn)行可操作單元（operational taxonomic units，OTUs）聚類和物種分類分析。
1.3.2三文魚優(yōu)勢(shì)腐敗菌的分離、純化及鑒定
選取4℃貯藏12 d的腐敗三文魚塊進(jìn)行微生物菌群結(jié)構(gòu)鑒定。將10 g魚肉倒入無(wú)菌蒸煮袋中，加入90 mL無(wú)菌生理鹽水，勻速拍打2 min制成菌懸液，10倍梯度稀釋后取1 mL稀釋液涂布于PCA培養(yǎng)基表面，每個(gè)稀釋梯度設(shè)置3個(gè)平行。選取菌落總數(shù)為30～300的平板，觀察菌落特征后，挑取平板上大小、形態(tài)、隆起程度、光澤度及顏色等不同的菌落接種于LB肉湯中，28℃振蕩培養(yǎng)12 h，然后在PCA培養(yǎng)基上劃線，于28℃培養(yǎng)24 h，重復(fù)2～3次，再挑取單菌落接種于LB肉湯中，28℃培養(yǎng)12 h，以10%（體積分?jǐn)?shù)）接種量傳代培養(yǎng)12 h至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，最后將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期菌液與等體積的50%（體積分?jǐn)?shù)）甘油水溶液混勻，置于－80℃冰箱中凍存保藏菌種。
將－80℃下保藏的菌種按照10%（體積分?jǐn)?shù)）的接種量加入LB肉湯中，28℃培養(yǎng)24 h進(jìn)行活化，傳代培養(yǎng)兩次后，取1 mL對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期菌液（107CFU/mL）到1.5 mL離心管中，在室溫下6 000 r/min離心5 min，收集菌體，用100μL無(wú)菌水重懸，再使用PCR儀提取細(xì)菌DNA（94℃、40 min），隨后在室溫下以6 000 r/min離心5 min，收集上清液在－20℃下保存。制備PCR擴(kuò)增體系擴(kuò)增細(xì)菌DNA，50μL體系組分為：1μL DNA樣品；2μL上、下游引物（10μmol/L）；25μLTaqPCR Master Mix（2×）和20μL無(wú)菌水。PCR程序：94℃、5 min；94℃、40 s，54℃、40 s，72℃、1 min，30個(gè)循環(huán)；72℃、5 min；4℃至反應(yīng)完成。
將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送至上海生工生物工程股份有限公司檢測(cè)基因序列。將測(cè)序得到的基因序列與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）中已知微生物基因序列進(jìn)行BLAST比對(duì)分析，采用MEGA 5分析16S rRNA結(jié)果，采用Neighor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。
1.3.3芳樟醇對(duì)莓實(shí)假單胞菌的抑菌性測(cè)定
1.3.3.1芳樟醇最小抑菌濃度的測(cè)定
采用96孔板稀釋法測(cè)定芳樟醇對(duì)莓實(shí)假單胞菌MS 02的最小抑菌質(zhì)量濃度（minimal inhibitory concentration，MIC）。將適量芳樟醇溶解于50%（體積分?jǐn)?shù)，下同）甲醇溶液，配制質(zhì)量濃度為8.00μg/mL的芳樟醇母液，采用二倍梯度稀釋法用50%甲醇溶液稀釋制得質(zhì)量濃度分別為4.00、2.00、1.00、0.50μg/mL的芳樟醇溶液備用。按照100μL/孔向96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中加入活化兩次后處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌液（107CFU/mL），再分別按照100μL/孔加入不同質(zhì)量濃度的芳樟醇溶液（終質(zhì)量濃度分別為4.00、2.00、1.00、0.50、0.25μg/mL），分別以等體積的50μg/mL氨芐青霉素、50%甲醇溶液作為陽(yáng)性對(duì)照和空白對(duì)照，每組3個(gè)平行。將96孔板置于28℃細(xì)菌培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h，再用酶標(biāo)儀于595 nm波長(zhǎng)處測(cè)定光密度值OD595 nm，選擇OD595nm低于陽(yáng)性對(duì)照組的最低質(zhì)量濃度作為芳樟醇對(duì)莓實(shí)假單胞菌的MIC。
1.3.3.2莓實(shí)假單胞菌MS 02生長(zhǎng)曲線的測(cè)定
采用抑菌曲線法評(píng)價(jià)芳樟醇對(duì)莓實(shí)假單胞菌MS 02的抑菌效果。取－80℃下保藏的莓實(shí)假單胞菌MS 02菌種，參考1.3.2節(jié)方法進(jìn)行活化，傳代培養(yǎng)兩次后吸取500μL對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌懸液（107CFU/mL）加入到25 mL LB肉湯當(dāng)中，充分振蕩均勻后再分別按照終質(zhì)量濃度MIC、2 MIC加入芳樟醇溶液，以等體積50%甲醇溶液作空白對(duì)照，在28℃、160 r/min的搖床中培養(yǎng)24 h，每隔2 h取樣，使用酶標(biāo)儀測(cè)定菌液595 nm處的光密度值OD595 nm。
1.3.3.3莓實(shí)假單胞菌MS 02形態(tài)觀察
采用SEM觀察莓實(shí)假單胞菌MS 02細(xì)胞形態(tài)變化。取－80℃下保藏的莓實(shí)假單胞菌MS 02菌種，參考1.3.2節(jié)方法進(jìn)行活化，傳代培養(yǎng)兩次后向?qū)?shù)生長(zhǎng)期的菌懸液（107CFU/mL）中加入芳樟醇，使菌懸液中芳樟醇的終質(zhì)量濃度為MIC和2 MIC，以等體積50%甲醇溶液為空白對(duì)照。在28℃、160 r/min的搖床中培養(yǎng)6 h后，6 000 r/min、4℃離心10 min收集菌體。以5 mmh5 mm的鋁片作承載物，將菌體置于質(zhì)量分?jǐn)?shù)2.5%的戊二醛溶液中固定4 h，再用無(wú)菌PBS洗滌3次，隨后依次以體積分?jǐn)?shù)30%、50%、70%、90%乙醇溶液和無(wú)水乙醇進(jìn)行梯度洗脫，每級(jí)靜置15 min，將試樣室溫放置12 h使其完全干燥后噴金觀察細(xì)胞形態(tài)。
1.3.3.4電導(dǎo)率的測(cè)定
取活化兩次培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的莓實(shí)假單胞菌液，8 000 r/min離心10 min，收集菌體，用PBS洗滌3次后制得重懸菌液（107CFU/mL），分別加入終質(zhì)量濃度為MIC和2 MIC的芳樟醇溶液，以等體積50%甲醇為空白對(duì)照。于搖床中培養(yǎng)6 h，每小時(shí)取樣測(cè)電導(dǎo)率。
1.3.3.5細(xì)胞膜通透性測(cè)定
通過(guò)FDA染色實(shí)驗(yàn)研究芳樟醇對(duì)莓實(shí)假單胞菌MS 02細(xì)胞膜通透性的影響。將活化兩次培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌液6 000 r/min、4℃離心15 min，收集菌體并重懸于PBS中，調(diào)整菌懸液濃度為107CFU/mL，再分別加入終質(zhì)量濃度為MIC和2 MIC的芳樟醇，以等體積50%甲醇為空白對(duì)照。搖床培養(yǎng)12 h，取各組菌懸液于6 000 r/min、4℃離心10 min收集菌體，用PBS洗滌2次后收集菌體，加入250μL FDA-丙酮溶液（2 mg/mL）。常溫下放置20 min后用PBS洗滌3次，8 000 r/min、4℃離心10 min，收集菌體并重懸于PBS中，用熒光分光光度計(jì)在激發(fā)波長(zhǎng)為297 nm、發(fā)射波長(zhǎng)為527 nm條件下測(cè)定樣品的FDA熒光強(qiáng)度，以表征細(xì)胞膜通透性。
1.3.3.6細(xì)胞膜完整性測(cè)定
按1.3.3.5節(jié)的方法制備重懸液（107CFU/mL）并分別加入終質(zhì)量濃度為MIC和2 MIC的芳樟醇，以等體積50%甲醇為空白對(duì)照，分別在28℃、160 r/min搖床中培養(yǎng)6 h，每3 h取1 mL的菌懸液，以6 000 r/min，4℃離心10 min，上清液過(guò)0.22μm濾膜過(guò)濾。取200μL濾液于96孔板中，使用酶標(biāo)儀于260 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其光密度值OD260 nm，每次實(shí)驗(yàn)3個(gè)平行。
1.3.3.7胞內(nèi)酶活力測(cè)定
將活化兩次培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌液以6 000 r/min、4℃離心15 min，收集菌體并重懸于PBS中，調(diào)整菌懸液濃度為107CFU/mL，再分別加入終質(zhì)量濃度為MIC和2 MIC的芳樟醇，以等體積50%甲醇為空白對(duì)照。搖床中培養(yǎng)6 h，離心收集菌體，加入PBS重懸，冰水浴超聲破碎菌體，每次超聲時(shí)間為5 s，間隔10 s，重復(fù)4次。參照AKP試劑盒說(shuō)明書方法，測(cè)定AKP活力。參照超微量ATP酶試劑盒說(shuō)明書測(cè)定鈉鉀ATP酶活力。
1.4數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析
實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)平行，實(shí)驗(yàn)結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，采用Tukey檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性分析，P＜0.05表示差異顯著。采用Origin 8.5軟件作圖。
利用細(xì)菌生長(zhǎng)曲線表征芳樟醇對(duì)三文魚莓實(shí)假單胞菌MS 02的抑菌效果（一）
利用細(xì)菌生長(zhǎng)曲線表征芳樟醇對(duì)三文魚莓實(shí)假單胞菌MS 02的抑菌效果（二）
相關(guān)新聞推薦
1、特雷唑來(lái)與其他抗結(jié)核藥物聯(lián)用使用對(duì)結(jié)核分枝桿菌的生長(zhǎng)抑制作用——資料與方法
2、頭孢菌素衍生物a對(duì)金葡菌、大腸桿菌生長(zhǎng)曲線的影響及抑制作用
3、貝萊斯芽孢桿菌B.velezensis B6生長(zhǎng)曲線、驅(qū)油功能特性評(píng)價(jià)（一）